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病毒中RNA提取纯化方法大全(试剂盒来助力)

发布者:艾美捷科技    发布时间:2021-07-29     
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在上一篇文章中,大家对SARS-CoV-2(新冠病毒)的结构和研究流程有了更深入的认识,阐明 了对SARS-CoV-2 生命周期动态的持续研究,有助于对病毒的诊断,同时对疫苗的的设计和开发至关重要。无论您是从细胞、组织还是病毒样本开始,高效的RNA分离通常是成功实验的第一步。这部分工作流程至关重要,因为足够的纯度和产量是确保下游应用顺利和准确运行的基本要求。特别是对病毒而言,其低丰度和高污染性的特点,使得要确保不含宿主衍生的杂质污染的高纯度的输入原料更加困难,因此,对于病毒RNA提取显得十分关键。这里小艾为大家整理了了10种常见的核酸纯化方法,重点是病毒RNA的分离。

 

一、过滤

膜过滤是一种物理分离技术,根据膜的性质(例如,孔隙率)和液体含量(例如,粒度),液体的内含物通过或被膜排除。通过选择具有适当孔径的膜,可以过滤液体病毒样本以排除细胞和其他大型非病毒污染物。

 

二、核酸酶处理

衣壳和包膜为病毒基因组提供了额外的保护层,防止核酸酶降解。DNAse和RNAse通常用于消除外源核酸,同时受保护的病毒基因组保持完整。

 

三、苯酚/氯仿抽提

可以使用苯酚/氯仿提取方法从病毒RNA基因组中分离宿主来源的基因组DNA和小RNA,该方法涉及将DNA 和RNA分别分为有机相和水相。首先,通过向含有核酸的样品中加入酸性苯酚和酸性缓冲液来产生单相溶液。氯仿的加入创建了一个双相系统,其中DNA和蛋白质分配到下层有机相,而上层水相保留RNA。水相可以另外用异丙醇处理,并通过基于硅胶柱的纯化处理,以提取总 RNA 或单个小RNA(miRNA、tRNA、5SrRNA、5.8SrRNA)和大RNA(mRNA、18SrRNA、28SrRNA) , snRNA) 分子,这取决于乙醇的浓度。

 

四、离心

低速离心:(例如,4℃下6000 ×g10分钟)是一种简单方便的病毒净化方式。细胞和大的细胞碎片被沉淀,上清液中悬浮的病毒粒子可以进行更严格的纯化。

超速离心:病毒的大小和密度不同于细胞器(例如线粒体、核糖体、细胞核)、生物大分子(例如 DNA、RNA、蛋白质)和污染病毒样本的其他宿主成分。超速离心利用这些物理化学特性将病毒与非病毒元素分离。这种分离通常是通过结合蔗糖和氯化铯密度梯度来实现的。在超速离心之前,细胞碎片在初始离心步骤中被清除。通过首先应用蔗糖密度梯度离心进一步去除剩余的杂质,该离心基于颗粒的 S 值或沉降系数进行分离。然后将氯化铯密度梯度平衡离心(根据其浮力密度分离颗粒)应用于所得病毒粗级分,以获得纯化的病毒片段。

 

五、沉淀

储存或下游应用(如感染和病毒基因组分离)通常需要浓缩的病毒制备物。已经开发出沉淀方法,以根据在无机盐或聚醚化合物(例如硫酸铵、PEG-6000)溶液中的溶解度,快速、轻松且低价地浓缩病毒并去除杂质。例如,据报道,在40%的饱和度水平下,硫酸铵会从补充有 10% FCS 的细胞培养基中诱导病毒沉淀,其中大部分(85%) 的蛋白质保持溶解状态。

 

六、柱层析

有多种色谱树脂(例如,蛋白A、阴离子交换、阳离子交换)可用,取决于色谱操作参数(例如,树脂类型;缓冲液组成和 pH值等),可用于将病毒与宿主分离核酸、蛋白质等。然而,这些方法需要昂贵的仪器、复杂的协议、专业的技术常识和训练有素的操作人员。

 

七、VIDISCA

腾讯体育直播基于cDNA扩增限制性片段长度多态性技术的病毒发现方法,或简称VIDISCA,允许优先扩增病毒核酸。血浆/血清和培养物上清输入样品已使用该方法成功测试。在典型的VIDISCA 方案中,病毒核酸首先通过离心和DNase处理选择性富集,以消除细胞、线粒体及其相关的遗传内容。然后提取封装的病毒基因组。对于冠状病毒等单链RNA病毒,需要使用随机六聚体引物进行逆转录步骤,然后是互补DNA的第二链合成。得到的双链DNA (dsDNA) 通过苯酚/氯仿抽提和乙醇沉淀进行纯化。纯化的dsDNA随后用限制酶处理,这些酶消化几乎所有病毒中存在的短识别序列。

腾讯体育直播大约80%的细胞总 RNA 是核糖体(rRNA),宿主来源的RNA构成了人类血浆样本中的大部分 RNA。因此,对VIDISCA协议进行了修改,加入了选择性rRNA消耗,以提高检测灵敏度和特异性。rRNA逆转录阻断寡核苷酸以及不能与rRNA退火的非随机六聚体的使用已被证明可以抑制非病毒cDNA合成并减少背景扩增。

 

腾讯体育直播八、用rRNA特异性DNA“剪刀探针”

选择性去除rRNA核糖体RNA污染也可以用rRNA杂交寡核苷酸探针和伴随的核酸酶介导的杂交消化。这些合成探针旨在补充特定的rRNA序列。RNase H处理导致rRNA/DNA双链体中rRNA的靶向切割,而DNase I用于去除残留探针。然后可以对去除了rRNA 的样品进行下游纯化。在适当的反应条件下,rRNA被特异性切割,同时保留了非杂交RNA 的完整性。

 

腾讯体育直播九、使用体外细胞培养物扩增病毒

腾讯体育直播鉴于病毒通常产生的滴度低,体外细胞培养物用于将病毒粒子扩增至分析相关的量。接种的 Vero和HEK293T细胞已有效用于病毒扩增目的。该方法包括在接种后24小时更换培养基,然后在另一个24小时孵育后从上清液中收集受感染细胞释放的病毒粒子。

 

十、商业病毒 RNA 提取试剂盒

基于柱和磁珠的方法为从临床标本中提取病毒 RNA 基因组提供了一种快速方便的方法。Epigentek提供各种用于分离RNA的磁珠和离心柱试剂盒来自不同样本来源(细胞、组织、全血、唾液、鼻咽拭子)和物种(病毒、哺乳动物、细菌、真菌、植物)。去污剂和离液盐用于裂解细胞和灭活 RNase。当污染物通过时,专门的高盐缓冲系统允许RNA碱基与磁珠或离心柱的玻璃纤维基质结合。杂质被有效地洗掉,纯核酸用水性缓冲液洗脱,无需苯酚提取或醇沉。这些试剂盒是下游PCR分析的理想选择;靶向病毒基因组的引物可与扩增宿主 DNA RNase P 基因的引物结合使用,该基因也与柱/珠结合并用作内部或提取控制。

 

商业病毒 RNA 提取试剂盒.png

 

病毒RNA提取试剂盒

目录号名称描述
P-9107EpiQuik 病毒 RNA 分离快速试剂盒只需 10 分钟即可快速纯化病毒 RNA。
P-9108EpiMag 病毒 RNA 分离试剂盒(磁珠)通过磁珠形式在 25 分钟内快速分离病毒 RNA。
P-9109EpiMag 96 孔病毒 RNA 提取试剂盒(高通量)通过磁珠形式在 30 分钟内高通量分离病毒 RNA,适用于自动化设置。

 

总 RNA 提取试剂盒

目录号名称描述
P-9105EpiQuik 总 RNA 分离快速试剂盒通过用于细胞和组织的基于柱的格式快速纯化 RNA。
P-9106EpiQuik Magbeads 快速 RNA 分离试剂盒通过用于细胞和组织的磁珠格式格式快速纯化 RNA。


P-9107结果:

P-9107结果:.jpg

 

当然,当上述方法单独进行不足以充分纯化病毒时,方法组合是一个不错的选择。专注于病毒表观基因组的研究需要高纯度的输入材料,不受宿主 DNA、RNA 或蛋白质的表观遗传修饰的干扰。上述方法的组合可以提高病毒回收率、产量和质量。举例来说,可以扩增低滴度 RNA 病毒,然后从接种的细胞培养物的上清液中回收。在核酸酶处理和离心去除宿主污染物之后,可以使用商业分离试剂盒提取病毒基因组,用于下游m6A RNA 甲基化分析。

 

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